Методические рекомендации и задания для самостоятельной работы к практическим занятиям (для студентов) ПМ.03 Проведение лабораторных биохимических исследований Тема: «Определение активности фосфатаз в сыворотке крови»


ТОГБПОУ «Тамбовский областной медицинский колледж»
Методические рекомендации и задания для самостоятельной работы к практическим занятиям
(для студентов)
ПМ.03
Проведение лабораторных биохимических исследований
Тема: «Определение активности фосфатаз в сыворотке крови»
Специальность: 31.02.03 «Лабораторная диагностика»
Курс: 1
Количество часов: 6
Преподаватель: Корчагина Т.В.
Тамбов, 2016
ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ
Тема: «Определение активности фосфатаз в сыворотке крови»
Цель работы: освоение методики определения активности щелочной и килой фосфатазы в сыворотке крови
Мотивация цели:
Фосфатазы (фосфомоноэстеразы) – группа ферментов, которые в норме поступают в кровь из печени, костного мозга, селезенки, почек, а при заболеваниях - из предстательной железы и других органах.
В клинической практике обычно определяют суммарную активность щелочных фосфатаз (фосфомоноэстераза I, оптимум рН 8,6-10,00) и кислых фосфатаз (фосфомоноэстераза II, оптимум рН 3,4-6,2), объединяя эти результаты одним термином «определение активности фосфатаз». При заболеваниях печени (механических желтухах) активность щелочной фосфтазы возрастает в 5-10 раз, особенно резко при рахите, в меньшей степени она повышается при острых гепатитах, холангитах, циррозах, при различных заболеваниях костной системы. Определение активности кислой фосфатазы в сыворотке крови имеет исключительно важное значение при диагностике заболеваний предстательной железы, особенно при раковых опухолях простаты.
Изучив тему, студенты должны:
Иметь практический опыт:
Определения показателей активности ферментов
Уметь:
Готовить материал к биохимическим исследованиям;
Принимать, регистрировать, отбирать клинический материал;
Вести учетно-отчетную документацию
Определять активность фосфатаз в сыворотке крови
Знать:
Правила работы и техники безопасности в биохимической лаборатории;
Механизм действия ферментов;
Клинико-диагностическое значение определения активности кислой и щелочной фосфатазы в сыворотке крови;
Нормальные показатели активности кислой и щелочной фосфатазы в сыворотке крови
После изучения ПМ.03 студент должен владеть:
общими компетенциями – ОК 1 –ОК 15
профессиональными компетенциями ПК:
Результаты (освоенные профессиональные компетенции)
Основные показатели результатов подготовки
ПК 3.1. Готовить рабочее место для проведения лабораторных биохимических исследований - осуществление доставки, приема, маркировки, регистрации, хранения, подготовки, оценки биоматериала;
- подготовка рабочего места, лабораторного оборудования и посуды для проведения биохимических исследований с соблюдением техники безопасности и противопожарной безопасности;
- использование нормативных документов при подготовке рабочего места
ПК 3.2. Проводить лабораторные биохимические исследования биологических материалов, участвовать в контроле качества - определение активности кислой и щелочной фосфатазы;
- интерпретация результатов проведенных исследований;
- Выполнение работы с аппаратурой для биохимических исследований, с дозаторами переменного и постоянного объема;
- использование нормативных документов при определении биохимических показателей;
ПК 3.3. Регистрировать результаты проведенных исследований - использование нормативных документов при проведении регистрации биохимических исследований;
- выполнение работ по оформлению учетно-отчетной документации;
- использование информационных технологий при ведении учетно-отчетной документации
ПК 3.4. Проводить утилизацию отработанного материала, дезинфекцию и стерилизацию использованной лабораторной посуды, инструментария, средств защиты - использование нормативных документов по соблюдению санитарно-эпидемиологического режима в биохимической лаборатории;
- соблюдении правил техники безопасности, охраны труда при проведении биохимических исследований;
- проведение мероприятий по соблюдению санитарно-эпидемиологического режима при проведении утилизации отработанного материала, дезинфекции лабораторной посуды, инструментария, средств защиты, рабочего места и аппаратуры
Уровень усвоения : 2 - репродуктивный (выполнение деятельности по образцу, инструкции или под руководством).
Межпредметные связи:
ПМ 01. Проведение лабораторных общеклинических исследований
Внутрипредметные связи:
Раздел ПМ 2. Проведение лабораторных биохимических исследований по определению активности ферментов
Тема 2.1. Свойства и кинетика ферментативных реакций
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Унифицированный метод определения активности щелочной фосфатазы по гидролизу n-нитрофенилфосфатаЩелочная фосфатаза содержится практически во всех тканях человека. Она образуется в костной ткани (остеобластах), костном мозге, клетках печени, почек, предстательной и молочной железах. Наибольшее ее количество сосредоточено в костной ткани.
Принцип метода:
Субстрат, пара-нитрофенилфосфат натрия, гидролизуется ферментом сыворотки крови с образованием пара-нитрофенола, окрашивающегося в щелочной среде в желтый цвет. Интенсивность окраски пропорциональна активности фермента.
Исследуемый материал : сыворотка крови
Состав набора:
Реагент № 1 Глициновый буфер 0,05 М, рН 10,4
Реагент № 2 Раствор едкого натра 0,2 М
Реагент № 3 n-нитрофенилфосфат 27,6 мМКалибровочный раствор n-нитрофенола – 50 мкмоль/л
Подготовка реагентов к процедуре анализа
Реагент № 2: содержимое флакона № 2 разведите дистиллированном водой в 10 раз
Рабочий реагент: смешайте реагент № 1 и реагент № 3 в соотношении 4:1.
Процедура анализа:
Подготовьте пробы следующего состава
Опытная проба Контрольная проба
Рабочий реагент, мл 0,5 0,5
Исследуемый материал, мл 0,05 -
Инкубируйте все пробы в течение 30 минут при 370С
Реагент №2,мл 5,0 5,0
Исследуемый материал, мл - 0,05
Пробы перемешайте и фотометрируйте опытные пробы против соответствующих контрольных проб при длине волны 405 нм.
Расчет активности фермента проведите по калибровочной кривой.
Построение калибровочной кривой:
Из основного калибровочного раствора (реагент №4) приготовьте следующие растворы:
№ пробы Калибровочный раствор, мл Реагент № 2 Активность фермента
нмоль/(с х л) К, коэффициент
1 0,5 5,05 278 2 1,0 4,55 556 3 1,5 4,05 834 4 2,5 3,05 1390 5 3,5 2,05 1945 Фотометрируйте калибровочные пробы против разведенного реагента № 2 при длине волны 405 нм.
По калибровочному графику рассчитайте средний коэффициент К = А/Е, где:
А – активность фермента, взятая из таблицы, Е – оптическая плотность соответствующей калибровочной пробы.
Активность фермента в исследуемой пробе (А пробы) рассчитайте по формуле:
А пробы = К х Е пробы, где
К – коэффициент, рассчитанный по калибровочному графику, Е пробы – оптическая плотность опытной пробы, измеренная против соответствующей контрольной пробы.
Нормальные значения:
Дети до 1 года – 830-2490 нмоль/ (с х л) или 50-159 МЕ/л
Дети 1- 12 лет – 560-1660 нмоль/(с х л) или 33-100 МЕ/л
Взрослые – 278 – 830 нмоль/ (с х л) или 16,7 – 50,0 МЕ/ЛКлинико-диагностическое значение определения ЩФ
Причины повышения активности ЩФ плазмы:
Физиологические:
Беременность (последний триместр)
Детский возраст
Менопауза
Патологические:
Превышение верхних границ нормы менее, чем в 5 раз:
Опухоли кости
Почечная остеодистрофия
Первичный гиперпаратиреоз с вовлечение кости
Заживающие переломы
Остеомиелит
Объемные поражения печени (опухоль, абсцесс)
Инфильтративное заболевание печени
Гепатит
Воспалительное заболевание желудка
Превышение верхней границы нормы более, чем в 5 раз:
Болезнь ПеджетаОстеомаляция и рахит
ХолестазЦирроз
Определение активности кислой фосфатазы в сыворотке крови унифицированным методом по «конечной точке»
Принцип метода:
n-нитрофенилфосфат + вода ------кислая фосфатаза-----n-нитрофенол + фосфат
Количество образовавшегося n-нитрофенола пропорционально активности фермента и определяется фотометрически.
Активность простатической фракции фермента блокируется тартратом.
Исследуемый материал:
Негемолизированная сыворотка крови
Состав набора:
Реагент № 1 0,09 М цитратный буфер, рН 4,8
Реагент № 2 0,02 М раствор тартрата калия
Реагент № 3 n-нитрофенилфосфат 32,7 Мм
Реагент№4 1М раствор едкого натра
Калибровочный раствор n-нитрофенола – 166,8 мг/л
Подготовка реагентов к процедуре анализа:
Рабочий реагент №1: смешайте содержимое флакона № 3 и содержимое флакона № 1 в соотношении 1:4
Реагент № 4 : содержимое флакона №4 разведите дистиллированной водой в 10 раз
ПРОЦЕДУРА АНАЛИЗА:
Подготовьте пробы следующего состава Общая активность проба «А» Тартратстабильная активность проба «Б» Контрольная проба
Рабочий реагент №1, мл 0,5 - 0,5
Рабочий реагент № 2, мл - 0,5 -
Исследуемый образец, мл 0,1 0,1 -
Пробы перемешивают и инкубируют при 370С ровно 30 минут. После окончания инкубации в опытную и контрольную пробы внесите по 2 мл реагента № 4. После этого в контрольную пробу добавьте 0,1 мл сыворотки и фотометрируйте пробы «А» и «Б» при длине волны 405 нм против соответствующей контрольной пробы.
Расчет активности произведите по калибровочной кривой. Из основного калибровочного раствора приготовьте рабочие растворы, как указано в таблице:
№ пробы Калибровочный раствор, мл Вода, мл Активность фермента нмоль/ (с х л)
1 0,1 1,9 41,7
2 0,2 1,8 83,3
3 0,5 2,0 166,7
4 1,0 1,0 416,7
5 1,0 - 833,5
В каждую из пяти пробирок внесите по 0,1 мл соответствующего калибровочного раствора, добавьте по 2,5 мл реагента №4, перемешайте и измерьте оптическую плотность против воды. Постройте график зависимости оптической плотности от активности фермента.
Активность пробы «А», найденная по калибровочному графику, соответствует общей активности фермента, активность пробы «Б» - тартратстабильной фракции фермента, разность активностей проб «А» и «Б» соответствует активности тартратстабильной (простатической) фракцииНормальные величины:
Общая активность – 67-167 нмоль /(с х л)
Простатическая фракция -0-16,7 нмоль/ (с х л)
Клинико-диагностическое значение:
Определение активности КФ используется для диагностики карциномы предстательной железы, при этом простатическая фракция имеет большое диагностическое значение, чем общая КФ. Однако в начальной стадии рака простаты активность кислой фосфатазы может находиться в пределах нормы. При метастазах карциномы предстательной железы в костную ткань может нарастать и активность щелочной фосфатазы.
Определение активности КФ может быть использовано для дифференциальной диагностики метастазов рака предстательной железы в кости и заболеваний костной ткани, в частности, остеодистрофий, для которых характерно повышение уровня только ЩФ, в то время как при костных метастазах рака предстательной железы повышен уровень как ЩФ, так и КФ
ЗАДАНИЕ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ
Тестовые задания по теме «Ферменты»
Выберите правильный ответ:
1.На результаты анализа могут повлиять следующие факторы внелабораторного характера:
а) прием медикаментов
б) прием медикаментов и положение тела
в) прием медикаментов, положение тела и используемые методы
2. На воспроизводимость результатов исследований влияет:
а) пипетированиеб) осаждение
в) изменение температуры
г) все перечисленное

3. При какой температуре инактивируется фермент:
а) 30о Сб) 37о Св) 40о Сг) 70о С
4. Субстратом для аспартатаминотрансферазы может служить:
а) альфа-аланинб) крахмал
в) аспарагиновая кислота
г) мальтоза

5. Расчет активности альфа-амилазы мочи по Вольгемуту производится:
а) визуально
б) по формуле
в) по таблице
г) по калибровочной кривой

6. При нарушении фильтрующей способности почек активность альфа-амилазы крови и мочи:
а) не изменяется
б) снижается
в) увеличивается резко в крови и снижается резко в моче
г) увеличивается незначительно
7. К незаменимым аминокислотам относятся:
а) лизин
б) метионин
в) треонинг) все перечисленные

8. Какую химическую реакцию катализирует фермент лактатдегидрогеназа?
а) переаминирования аминокислот
б) фосфорилирования глюкозы
в) углекислого газа, воды и лактатаг) окисления молочной кислоты
9. Для альфа-амилазы субстратом может служить:
а) крахмал
б) сахароза
в) фруктоза
г) аминокислота
10. Расчет активности аминотрансфераз в сыворотке крови по Рейтману и Френкелю производится:
а) визуально
б) по формуле
в) по калибровочной кривой
г) по таблице

11. Как изменяется активность альфа-амилазы крови и мочи при остром панкреатите?
а) чаще всего увеличивается в 10-30 раз
б) не изменяется
в) снижается
г) слегка увеличивается
12. Для приготовления плазмы из цельной крови применяют:
а) 3% раствор трихлоруксусной кислоты
б) 3,8% раствор цитрата натрия
в) 0,11 М раствор цитрата натрия
г) 0,1 М раствор оксалата натрия
13. Плазма считается непригодной для исследования, если:
а) имеются следы гемолиза
б) повышена концентрация билирубина
в) видны нити фибрина
г) все перечисленное верно
14. Для получения плазмы, содержащей кровяные пластинки, кровь центрифугируют:
а) 10-15 мин при 3000 об/мин
б) 5 мин при 2000 об/мин
в) 5-8 мин при 1000-1500 об/мин
15. Активность АлАТ и АсАТ определяют по количеству образовавшихся при переаминировании а) пировиноградной кислоты
б) щавелевоуксусной кислоты
в) аланинаг) аспарагиновой кислоты

16. Определение активности альфа-амилазы используют для диагностики

а) панкреатита
б) атеросклероза
в) подагры
г) инфаркта миокарды
ЗАКОНЧИТЬ ФРАЗУ:
17. « В норме соотношение АсАТ/АлАТ (коэффициент де Ритиса) равно 1,33, но при инфаркте миокарда оно … …»
УСТАНОВИТЕ СООТВЕТСТВИЕ:
18. Установите соответствие между ферментами и их локализацией в органах и тканях:
Ферменты: Локализация ферментов в органах и тканях:
1. АсАТ а) печень
2. АлАТ б) сердце
3. Щелочная фосфатазав) скелетные мышцы
4.кислая фосфатазаг) кости
5. ЛДГ1 д) предстательная железа
6. ЛДГ5 е) почки
7.Креатинкиназа
19. Установите соответствие между изоферментами ЛДГ и составами IV структуры:
Изоферменты ЛДГСостав IV структуры
А) ЛДГ1 1. 4Н
Б) ЛДГ2 2. 4М
В) ЛДГ3 3. 3Н1М
Г) ЛДГ4 4. 3М1Н
Д) ЛДГ5 5. 2М2Н
20.Какие из перечисленных ферментов катализируют химические реакции?
Ферменты Химические реакции
А) альфа-амилаза 1. переаминированиеБ) аспартатаминотрансфераза 2. гидролиз
В) лактатдегидрогеназа 3. окисление и восстановление декарбоксилаза 4.отщепление от субстрата СО2УСТАНОВИТЕ ПРАВИЛЬНУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:
21. Проведения этапов анализа на активность аминотрансферазы в сыворотке крови по Райтману и Френкелю:
1. остановка ферментативной реакции переаминирования2. инкубация субстратного раствора при 37оС
3. ферментативная реакция переаминирования4. обнаружение образовавшегося продукта реакции - ПВК
5. расчет результата анализа по калибровочной кривой.
22.Проведение этапов анализа определения активности альфа-амилазы мочи по Вольгемуту:
а) разведение мочи
б) обнаружение оставшегося неизрасходованного субстрата крахмала
в) расчет результата анализа визуально
г) остановка ферментативной реакции
д) ферментативный гидролиз крахмала
23. К буферным системам крови относится:
а) бикарбонатная
б) белковая
в) гемоглобиновая
г) все перечисленное верно

24. Активность АлАТ в сыворотке крови увеличивается при желтухе:
а) механической
б) паренхиматозной
в) гемолитической
г) все перечисленное верно

25. Наибольшая активность креатинкиназы обнаруживается при:
а) аденоме предстательной железы
б) патологии костной ткани
в) подагре
г) инфаркте миокарда

26. При холестазе наиболее информативно определение:
а) холинэстеразы б) аминотрансферазы в) ЩФ
г) ЛДГ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
Основная:
1. В.С. Камышников Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике, М., МЕДпресс - информ, 2010.
2. А.А. Кишкун Руководство по лабораторным методам диагностики, М.: ГОЭТАР-Медия, 2007.
3. В.К. Кухта, Т.С. Морозкина, А.Д. Таганович, Э.И. Олецкий, Основы биохимии учебник для учащихся мед.училищ, М, Медицина,1999.
4. Л. М. Пустовалова Основы биохимии для медицинских колледжей, Ростов –на-Дону, Феникс 2013.
5. Л.М. Пустовалова Практикум по биохимии, Ростов –на-Дону, Феникс 2010.
Дополнительная:
1. Долгов В.В., Селиванова А.В. Биохимические исследования в клинико-диагностических лабораториях ЛПУ первичного звена здравоохранения - М.: изд-во ВиталДиагностикс, 2010
2. Елисеева Е.Е. Анализы. Полный справочник – М.: изд-во Эксмо, 2010.
3. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике - М., «МЕДпресс-информ», 2004.
4. Кишкун А.А. Руководство по лабораторным методам диагностики. М. - ГЭОТАР-Медиа, 2007.
5. Козинец Т.И. Интерпретация анализов крови и мочи. М.: 1998.
6. В.М., Лифшиц, В.И. Сидельникова Медицинские лабораторные анализы, Триада – Х, М, 2000.
7. Маршалл В.Дж. «Клиническая биохимия». М.: 1999.
8. Меньшиков В.В. Управление качеством клинических лабораторных исследований. Нормативные документы. - М., 2000.
9. Ткачук В.А. Клиническая биохимия. – 2-е изд., испр. и доп. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004.
Интернет-ресурсы:
BioximiaForYou http://bioximia.narod.ru/index/0-285Биохимия для студента http://biokhimija.ruПриложение
ИНСТРУКЦИИ К ДИАГНОСТИЧЕСКИМ НАБОРАМ



Приложенные файлы

  • docx file10
    Размер файла: 2 MB Загрузок: 0

Добавить комментарий