Методические рекомендации и задания для самостоятельной работы к практическим занятиям (для студентов) ПМ.03 Проведение лабораторных биохимических исследований Тема: «Определение активности аминотрансфераз в сыворотке крови кинетическим методом»


ТОГБПОУ «Тамбовский областной медицинский колледж»
Методические рекомендации и задания для самостоятельной работы к практическим занятиям
(для студентов)
ПМ.03
Проведение лабораторных биохимических исследований
Тема: «Определение активности аминотрансфераз в сыворотке крови кинетическим методом»
Специальность: 31.02.03 «Лабораторная диагностика»
Курс: 1
Количество часов: 6
Преподаватель: Корчагина Т.В.
Тамбов, 2016ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ
Тема: « Определение активности аминотрансфераз в сыворотке крови кинетическим методом»
Цель занятия: освоение методики определения активности АлАт и АсАт в сыворотке крови
Мотивация цели:
Аминотрансферазы - ферменты, катализирующие межмолекулярный перенос аминогруппы от соответствующих аминокислот на альфа-кетокислоты (2-оксокислоты) с образованием новых кето- и аминокислот без образования свободного аммиака, в качестве кофермента используется витамин В6 (пиридоксин). Эти ферменты играют центральную роль в обмене белков, осуществляя дезаминирование аминокислот опосредовано через глутаминовую кислоту. В организме человека наибольше значение имеют две аминотрансферазы: аспартатаминотрансфераза и аланинаминотрансфераза. Определение активности АСТ и АЛТ является чувствительным тестом для диагностики инфаркта миокарда, который не выявляется на ЭКГ. Определение активности АлАт используется для диагностики заболеваний печени (острый гепатит).
Изучив тему, студенты должны:
Иметь практический опыт:
Определения показателей активности ферментов
Уметь:
Готовить материал к биохимическим исследованиям;
Принимать, регистрировать, отбирать клинический материал;
Вести учетно-отчетную документацию
Определять активность ферментов АлАт и АсАтЗнать:
Правила работы и техники безопасности в биохимической лаборатории;
Механизм действия ферментов;
Клинико-диагностическое значение определения активности ферментов АлАт и АсАт;
Нормальные показатели активности ферментов АлАт и АсАт в сыворотке крови
После изучения ПМ.03 студент должен владеть:
общими компетенциями – ОК 1 –ОК 15
профессиональными компетенциями ПК:
Результаты (освоенные профессиональные компетенции)
Основные показатели результатов подготовки
ПК 3.1. Готовить рабочее место для проведения лабораторных биохимических исследований - осуществление доставки, приема, маркировки, регистрации, хранения, подготовки, оценки биоматериала;
- подготовка рабочего места, лабораторного оборудования и посуды для проведения биохимических исследований с соблюдением техники безопасности и противопожарной безопасности;
- использование нормативных документов при подготовке рабочего места
ПК 3.2. Проводить лабораторные биохимические исследования биологических материалов, участвовать в контроле качества - определение активности ферментов АлАт, АсАт в сыворотке крови;
- интерпретация результатов проведенных исследований;
- Выполнение работы с аппаратурой для биохимических исследований, с дозаторами переменного и постоянного объема;
- использование нормативных документов при определении биохимических показателей;
ПК 3.3. Регистрировать результаты проведенных исследований - использование нормативных документов при проведении регистрации биохимических исследований;
- выполнение работ по оформлению учетно-отчетной документации;
- использование информационных технологий при ведении учетно-отчетной документации
ПК 3.4. Проводить утилизацию отработанного материала, дезинфекцию и стерилизацию использованной лабораторной посуды, инструментария, средств защиты - использование нормативных документов по соблюдению санитарно-эпидемиологического режима в биохимической лаборатории;
- соблюдении правил техники безопасности, охраны труда при проведении биохимических исследований;
- проведение мероприятий по соблюдению санитарно-эпидемиологического режима при проведении утилизации отработанного материала, дезинфекции лабораторной посуды, инструментария, средств защиты, рабочего места и аппаратуры
Уровень усвоения : 2 - репродуктивный (выполнение деятельности по образцу, инструкции или под руководством).
Межпредметные связи:
ПМ 01. Проведение лабораторных общеклинических исследований
Внутрипредметные связи:
Раздел ПМ 2. Проведение лабораторных биохимических исследований по определению активности ферментов
Тема 2.1. Свойства и кинетика ферментативных реакций
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Определения активности аланинаминотрансферазы в сыворотке крови методом Райтмана-Френкеля.
Принцип метода : Под действием фермента аланинаминотрансферазы (АЛТ) в результате переаминирования происходит перенос аминогруппы с аланина на α-кетоглутарат. Активность АЛТ пропорциональна количеству образовавшихся динитрофенилгидразонов пирувата в щелочной среде, которое определяется фотометрически.
Схема реакции:
АЛТ L-аланин + α-кетоглутарат _______> пируват + L-глутамат
Исследуемый материал: Свежая сыворотка крови и плазмы без следов гемолиза. Активность фермента в сыворотке снижается после 3-х дней хранения при t 2-8°С на 10%, при t 18-25°С на 17%.
Состав набора:
Реагент № 1. Буфер-субстратный раствор.
Реагент № 2. Раствор 2,4-ДНФГ.
Реагент № 3. Натрий едкий.
Калибратор (раствор пирувата натрия ) – 1,0 ммоль/л.
Подготовка реагентов к процедуре анализа и их стабильность:
Реагенты № 1, № 2 и калибратор готовы к применению. Калибратор после вскрытия флакона стабилен не менее 6 месяцев при температуре 2-8°С. Содержимое флакона №3 (или аликвоту) следует развести бидистиллированной водой в 10 раз; хранить в полиэтиленовой таре.
Процедура анализа:

Пробы перемешайте и инкубируйте 20 минут при комнатной температуре (18-25°С). Затем в пробирки внесите по 2,5 мл разведенного реагента № 3, перемешайте реакционную смесь и через 10 минут (18-25°С) измерьте оптические плотности опытных и соответствующих контрольных проб против дистиллированной воды при длине волны 537 нм (500-560 нм). Интенсивность окраски стабильна не менее часа в защищенном от света месте.
Расчет:
Активность аланинаминотрансферазы выражается в единицах, которые определяются количеством образовавшегося пирувата (ммоль или мкмоль) за единицу времени (час или секунда) в единице объема (литр) биологической жидкости.
Расчет активности (А) фермента проведите по формуле:
А = (Е опыт – Е контр.) х К,
где: Е опыт – оптическая плотность опытной пробы, Е контр. – оптическая плотность соответствующей контрольной пробы,К – коэффициент, рассчитанный по калибровочному графику.
При активности фермента, превышающей 4 ммоль/(ч х л) или 1,112 мкмоль/(с х л), сыворотку крови рекомендуется развести физиологическим раствором и учесть степень разведения при расчете.

Построение калибровочного графика
Содержимое пробирок тщательно перемешайте. Инкубируйте 20 минут при комнатной температуре (18-25°С). Затем во все пробирки внесите по 5,0 мл разведенного реагента №3, перемешайте реакционную смесь и через 10 минут (18-25°С) измерьте оптические плотности калибровочных растворов против контроля при длине волны 537 нм (500-560 нм).
Постройте график зависимости оптической плотности от активности фермента. По калибровочному графику рассчитайте коэффициент
К = А / Е, где А – активность фермента, взятая из таблицы, Е – экстинкция соответствующей калибровочной пробы.
Нормальные показатели:
АЛТ - до 0,19 мкмоль/(с x л) или до 0,68 ммоль/(час x л).
ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ АСПАРТАТАМИНОТРАНСФЕРАЗЫ В СЫВОРОТКЕ И ПЛАЗМЕ КРОВИ УНИФИЦИРОВАННЫМ МЕТОДОМ РАЙТМАНА-ФРЕНКЕЛЯ
Принцип метода:
Под действием фермента аспартатаминотрансферазы (АСТ) в результате переаминирования происходит перенос аминогруппы с аспартата на α-кетоглутарат. Активность АСТ пропорциональна количеству образо- вавшихся динитрофенилгидразонов пирувата и оксало- ацетата в щелочной среде, которое определяется фотометрически.
Схема реакции:
L-аспартат + α-кетоглутарат ← АсАТ → оксалоацетат + L-глутаматИсследуемый материал:
Свежая сыворотка крови и плазмы без следов гемолиза. Активность фермента в сыворотке снижается после 3-х дней хранения при температуре 2-8°С на 10%, при температуре 18-25°С на 17%.
Состав набора:
Реагент №1. Буфер-субстратный раствор.
Реагент №2. Раствор 2,4-ДНФГ.
Реагент №3. Натрий едкий.
Калибратор (раствор пирувата натрия ) – 1,0 ммоль/л.
Подготовка реагентов к процедуре анализа и их стабильность:
Реагенты № 1 и № 2 готовы к применению. Калибратор готов к применению. Калибратор после вскрытия флакона стабилен не менее 6-ти месяцев при температуре 2-8°С. Содержимое флакона №3 (или аликвоту) следует развести бидистиллированной водой в 10 раз;
Процедура анализа:

Пробы перемешайте и инкубируйте 20 минут при комнатной температуре (18-25°С). Затем в пробирки внесите по 2,5 мл разведенного реагента №3, перемешайте реакционную смесь и через 10 минут (18-25°С) измерьте оптические плотности опытных и соответствующих контрольных проб против дистиллированной воды при длине волны 537 нм (500-560 нм). Интенсивность окраски стабильна не менее часа в защищенном от света месте.
Расчет:
Активность аспартатаминотрансферазы выражается в единицах, которые определяются количеством образовавшегося пирувата (ммоль или мкмоль) за единицу времени (час или секунда) в единице объема (литр) биологической жидкости.
Расчет активности (А) фермента проведите по формуле:
А = (Е опыт. - Е контр.) х К, где:
Е опыт. – оптическая плотность опытной пробы, Е контр. - оптическая плотность соответствующей контрольной пробы, К – коэффициент, рассчитанный по калибровочному графику.
При активности фермента, превышающей 4 ммоль/(ч х л) или 1,112 мкмоль/(с х л), сыворотку крови рекомендуется развести физиологическим раствором и учесть степень разведения при расчете.
Построение калибровочного графика

Содержимое пробирок тщательно перемешайте. Инкубируйте 20 минут при комнатной температуре (18-25°С). Затем во все пробирки внесите по 5,0 мл разведенного реагента №3, перемешайте реакционную смесь и через 10 минут (18-25°С) измерьте оптические плотности калибровочных растворов против контроля при длине волны 537 нм (500-560 нм). Постройте график зависимости оптической плотности от активности фермента.
По калибровочному графику рассчитайте коэффициент К=А/Е,
где А – активность фермента, взятая из таблицы, Е – экстинкция соответ- ствующей калибровочной пробы.
Нормальные показатели для АСТ - до 0,19 мкмоль/(с х л) или до 0,68 ммоль/(час х л).
Клинико-диагностическое значение определение активности аминотрансфераз в сыворотке крови
В связи с тем, что специфическая активность АЛТ в печени почти в 10 раз выше, чем в миокарде и скелетной мускулатуре, повышенная активность этого фермента в сыворотке рассматривается как индикатор поражения паренхимы печени. Измерение активности АСТ показано при мониторинге и дифференциальной диагностике заболеваний гепатобилиарной системы, инфаркте миокарда и повреждениях скелетной мускулатуры. Активность АСТ повышается также при туберкулезе легких, септицемии, герпетической инфекции, опухолях разной локализации, кетоацидозе, азотемии. Снижение активности АСТ может встречаться при малярии и беременности.
Причины повышения активности аминотрансфераз плазмы:
Превышение верхнего предела нормы мене, чем в 5 раз:
Физиологическое (у новорожденных)
Другие болезни печени (кроме указанных ниже)
Панкреатит
Гемолиз
Прием алкоголя, салицилатов, стероидов, оральных контрацептивов, ингибиторов МАО, опиатов, сульфаниламидов, барбитуратов, препаратов меди и железа, антибиотиков, пиридоксина и других лекарственных препаратов.
Превышение верхнего предела нормы в 5-10 раз:
Инфаркт миокарда
Травма или хирургическое вмешательство
Заболевания скелетных мышц
ХолестазХронический гепатит
Превышение верхнего предела нормы более чем в 10 раз:
Острый гепатит и некроз печени
Тяжелый синдром сдавления
Тяжелая гипоксия тканей
Референсные значения:
АЛТ АСТ
Мужчины < 45 Е/л < 35 Е/л
Женщины < 34 Е/л < 31 Е/л
ЗАДАНИЕ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ
ТЕСТ ПО ТЕМЕ: «ФЕРМЕНТЫ»
1. Активность АЛТ и АСТ определяются по кислоте:
А) -кетоглутаровой
Б) ПВК
В) аланинуГ) ЩУК
2. Скорость ферментативной реакции зависит от:
А) концентрации субстрата
Б) температуры
В) рН среды
Г) все перечисленное верно
3. Механизм действия фермента связан с:
А) снижением энергии активации
Б) увеличением энергии активации
В) изменением самого фермента
Г) все перечисленное
4. По своей химической природе ферменты являются:
А) белками
Б) углеводами
В) липидами
Г) нуклеиновыми кислотами
5. Ферменты, катализирующие одну и ту же реакцию, но отличающиеся по некоторым свойствам, называются:
А) коферменты
Б) апоферменты
В) изоферменты
Г) холоферменты6. Глюкоза используется для диагностики:
А) сахарного диабета
Б) гепатита
В) острого панкреатита
Г) инфаркта миокарда
7. Оптимальная температура активности фермента составляет:
А) 10 - 15 СБ) 37 - 40 СВ) 20 - 30 СГ) 45 - 50 С8. Активность АЛТ в сыворотке крови увеличивается при желтухе:
А) механической
Б) паренхиматозной
В) гемолитической
Г) все перечисленное
9. Трансаминирование аминокислот катализирует:
А) ксантиноксидазаБ) амилаза
В) аминотрансферазаГ) липаза
10. АЛТ и АСТ катализируют реакцию:
А) гидролиза
Б) переноса аминогрупп
В) внутримолекулярных превращений
Г) синтеза
11. Наиболее показательным для диагностики заболевания костной системы является определение сывороточной активности:
А) кислой фосфатазы
Б) аминотрансферазыВ) амилазы
Г) щелочной фосфатазы
12. Ферменты:
А) увеличивают скорость реакции
Б) термолабильны
В) высокоспецифичныГ) все перечисленное верно
13. К классу гидролаз относится:
А) пепсин
Б) ксантиноксидазаВ) трансаминазаГ) лактатдегидрогеназа14. Источником аналитических ошибок при определении активности ферментов может быть:
А) недостаточная концентрация субстрата, насыщающая фермент
Б) изменение рН инкубационной смеси
В) нестабильность t  в ходе инкубации
Г) все перечисленное верно
15. К ингибиторам ферментов относятся:
А) соли тяжелых металлов и органические кислоты
Б) вода
В) соли щелочных и щелочно-земельных металлов
Г) физиологический раствор хлорида натрия
16. В процессе ферментативной реакции субстрат соединяется:
А) только с активным центром
Б) только с аллостерическим центом
В) со всей молекулой фермента
Г) с активным и аллостерическим центрами
17. Наибольшая активность креатинкиназы обнаруживается при:
А) аденоме предстательной железы
Б) патологии костной ткани
В) подагре
Г) инфаркте миокарда
18. При холестазе наиболее информативно определение:
А) холинэстеразыБ) аминотрансферазыВ) ЩФ
Г) ЛДГ
19. Наибольшая активность АЛТ обнаруживается в клетках:
А) миокарда
Б) печени
В) скелетных мышц
Г) почек
20. Катал – это единица, отражающая:
А) концентрацию фермента
Б) концентрацию ингибитора
В) активность фермента
Г) коэффициент молярной экстинкции
21. Повышение активности ферментов является следствием:
А) увеличения его синтеза
Б) увеличения проницаемости клеточных мембран
В) усиления местного кровотока
Г) всего перечисленного
22. Активность ферментов можно оценить по изменению:
А) концентрации субстрата
Б) концентрации продукта реакции
В) по обоим перечисленным показателям
Г) ни по одному из них
23. При диагностике инфаркта миокарда определяют активность:
А) АСТ и АЛТ, ЛДГ, КК и их изоферментов
Б) АЛТ, ЛДГ, ЩФ и КФ
В) ГГТ, АЛТ, альфа-амилазыГ) ЛДГ, ГГТ, КФ
24. Для исследования ферментов сыворотки крови используются методы:
А) спектрофотометрический
Б) фотоэлектроколориметрическийВ) электрофоретический
Г) все перечисленные
25. Наибольшая активность КФК характерна для:
А) эритроцитов
Б) печени
В) мышц
Г) почек
26. Активность ферментов, выраженная в международных единицах - это:
А) моль/час/лБ) моль/сек/лВ) мкмоль/мин/лГ) мкмоль/час/мл
27. Скорость ферментативной реакции зависит от:
А) t
Б) рН
В) концентрации субстрата
Г) всего перечисленного
28. Изменение активности ферментов при транспортировке может меняться из-за:
А) разрушения четвертичной структуры фермента
Б) изменения рН
В) гемолиза
Г) всего перечисленного
29. Подъем активности АсТ в сыворотке при инфаркте миокарда начинается через:
А) 1 - 5 час.
Б) 5 - 8 час.
В) 9 - 15 час.
Г) только при осложненном инфаркте
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
Основная:
1. В.С. Камышников Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике, М., МЕДпресс - информ, 2010.
2. А.А. Кишкун Руководство по лабораторным методам диагностики, М.: ГОЭТАР-Медия, 2007.
3. В.К. Кухта, Т.С. Морозкина, А.Д. Таганович, Э.И. Олецкий, Основы биохимии учебник для учащихся мед.училищ, М, Медицина,1999.
4. Л. М. Пустовалова Основы биохимии для медицинских колледжей, Ростов –на-Дону, Феникс 2013.
5. Л.М. Пустовалова Практикум по биохимии, Ростов –на-Дону, Феникс 2010.
Дополнительная:
1. Долгов В.В., Селиванова А.В. Биохимические исследования в клинико-диагностических лабораториях ЛПУ первичного звена здравоохранения - М.: изд-во ВиталДиагностикс, 2010
2. Елисеева Е.Е. Анализы. Полный справочник – М.: изд-во Эксмо, 2010.
3. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике - М., «МЕДпресс-информ», 2004.
4. Кишкун А.А. Руководство по лабораторным методам диагностики. М. - ГЭОТАР-Медиа, 2007.
5. Козинец Т.И. Интерпретация анализов крови и мочи. М.: 1998.
6. В.М., Лифшиц, В.И. Сидельникова Медицинские лабораторные анализы, Триада – Х, М, 2000.
7. Маршалл В.Дж. «Клиническая биохимия». М.: 1999.
8. Меньшиков В.В. Управление качеством клинических лабораторных исследований. Нормативные документы. - М., 2000.
9. Ткачук В.А. Клиническая биохимия. – 2-е изд., испр. и доп. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004.
Интернет-ресурсы:
BioximiaForYou http://bioximia.narod.ru/index/0-285Биохимия для студента http://biokhimija.ruПриложение
ИНСТРУКЦИИ К ДИАГНОСТИЧЕСКИМ НАБОРАМ




Приложенные файлы

  • docx file21
    Размер файла: 3 MB Загрузок: 0

Добавить комментарий